プラスミド ベクター。 BraInSitu For Beginners

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プラスミド ベクター

Contents• はじめに <脳研究におけるISH法〜Molecular biologyとNeuroanatomyの接点> 脳研究においてISH法を最大限活用するためには、Molecular biologyとNeuroanatomyの両方マスターする必要があります。 これは、実はかなり難しいことです。 例えばMolecular biology中心のラボにとって、プローブを作るのは比較的簡単ですが、組織学的な解析は困難であり、何よりもNeuroanatomyの知識がなけれ ば、表面的な結果の解釈しかできません。 逆に多くのNeuroanatomistにとっては、Molecular biologyの技術には馴染みがないだろうと思います。 このセクションでは、実験を実際に行う上で必要と思われる背景知識に焦点を絞って、補足の説明をいくつか書いてみました。 「分子生物学初心者へ」の項目 は、分子生物学に馴染みのない人をターゲットに、プロトコルで説明無しに使用した用語の説明を行っています。 「組織学初心者へ」は自分の経験を踏まえて、 アドバイス的な文章を書いてみました。 参考にしていただけたら幸いです。 分子生物学初心者へ 〜クローニングとは何か:基本の基本 In situ hybridization ISH 法ではターゲットになるmRNAに相補的なアンチセンスRNAを合成する必要があります。 RNAの人工合成にはRNAポリメラーゼを使います。 これらのポリメラーゼは20塩基対くらいの特定の配列(プロモーター)を認識 し、それ以降のDNA配列に対応するRNAを合成します。 RNAポリメラーゼで合成される元になるDNAを鋳型 template と呼び、その鋳型を元 にしたRNA合成を転写と呼びます。 試験管内 in vitro で転写を起こすのに3つの要素が必要です。 すなわち、RNAポリメラーゼ、そのポリメラーゼが認識するプロモーターを含む鋳型DNA、及び RNAの原料であるATP, GTP, CTP, UTP(NTPと総称)の3つです。 このin vitro転写反応の際にdigoxigenin DIG , Fluorescein FITC , biotinなどの低分子で修飾したUTPを一定の割合で混ぜておくと、合成されるRNAにDIG, FITC, biotinが取り込まれ、目印になります。 さてRNAポリメラーゼや、NTP、 DIG-UTPなどはいろんなメーカーで市販していますが、鋳型DNAは自分の調べたい遺伝子のものを用意する必要があります。 DNAを大量に生成する標 準的なやり方は、目的のDNA断片をプラスミドベクターにクローニングし、大腸菌で増やすことです。 <プラスミドベクター> 分 子生物学の最も基本的なツールがプラスミドベクターです。 プラスミドとは、通常、数千塩基対からなる環状DNAで大腸菌で増殖することのできる複製起点 ori を有するものを指します。 もともとは自然界に存在しているものですが、それを人工的に改変し分子生物学のツールとして使いやすくしたものがいわ ゆる「ベクター(運び屋)」です。 プローブ用に使われるベクターにはさまざまな種類のものがありますが、我々はpBluescript II(pBS II)というベクターを使っています。 Bluescriptベクターの構成を図示しました。 プラスミ ドベクターは一般に、大腸菌内で増殖するのに必須な複製起点と、クローン選別のための薬剤耐性遺伝子(通常はアンピシリン耐性)を持っています(後述ク ローン選別の項参 照)。 Bluescriptベクターの場合、この他にT3プロモーター配列とT7プロモーター配列が向かい合わせに配置されていて、この間に multicloning site MCS と呼ばれる領域があります。 目的とする遺伝子配列がRNAポリメラーゼのプロモーター下流に「クローニング」されたプラスミドが、in vitro転写の鋳型作りの材料となります。 <クローニング> プラスミドベクターに目的のDNA断片が挿入された組換プ ラスミドを作成することをクローニングと呼びます。 なぜクローニングと呼ぶのかというと、プラスミド作成過程で「クローン」選別を行うからです。 クローニ ングの際にはベクタープラスミドを切断したDNAと、目的遺伝子のDNA断片(インサートと呼びます)を酵素 DNA ligase を使って連結します(ライゲーションと呼ぶ)。 この中から目的のプラスミドを「クローン選 別」します。 「クローン選別」の第一歩は大腸菌の形質転換(トランスフォーメーション)です。 <形質転換(トランスフォーメーション)> 大 腸菌をカルシウムなどで処理すると、膜の状態が変化して外部のDNAを取り込みやすい状態になります。 このような大腸菌をコンピテントセルと呼びます(我 々はコンピテントセルは自前で作成していますが、購入も可能です)。 コンピテントセルとライゲーション反応液を混ぜると、大腸菌内にプラスミドDNAが取 り込まれプラスミド上に乗っている遺伝子が機能して大腸菌の性質が変化します。 この操作を形質転換(トランスフォーメーション)と呼びます。 <クローン選別> Bluescriptにはアンピシリン耐性遺伝子が乗っているので、Bluescriptベクターを取り込んだ大腸菌はアンピシリンに耐性となります。 従ってアンピシリンを含む培地に大腸菌を「まく」と、Bluescriptを取り込んだ大腸菌が選別されます。 大腸菌を「まく」とは、アンピシリンを含む 寒天培地上に塗布することを言います。 このとき適切な濃度でまいて、「コロニー」と呼ばれる菌集団が、数十から数百個ほど寒天培地上に分散して形成される ようにします。 ここで注意して欲しいのはこのコロニーは一個一個が別々の「クローン」であるということです。 トランスフォーメーションの際には、確率的に 普通1分子のベクターDNAが1個の大腸菌に取り込まれます。 コロニーとは、この1個の大腸菌が指数関数的に増殖し、一晩で目に見えるくらい大きな細胞集 団になったものなのです。 従って、同じコロニーの中の大腸菌は原理的には同じプラスミドを持った「クローン」であり、別のコロニーの大腸菌はそれとは別の プラスミドを持つ「クローン」だと言うわけです。 プレートに生えたたくさんの大腸菌のコロニーの中から、目的とするDNA断片が挿入され たプラスミドを持つコロニーを選別するには、それぞれのコロニーを形成している大腸菌クローンを増殖してそこからプラスミドDNAを精製し、その構造を確 認します。 もしDNA断片がベクター配列内に挿入されていることが確認されれば、クローニングが成功したことになります。 <In vitro転写用の鋳型つくり> 遺伝子配列のすぐ後の適当な制限酵素でプラスミドを切断する。 例えば、この場合T7ポリメラーゼで転写反応を行うと、アンチセンスRNAが転写されて、切 断部位で転写は停止する。 センス用には反対側で切断する。 > 別の方法 遺伝子をはさんだ両側にプライマーを設定しPCRを行い、増幅したDNA断片を鋳型として転写反応を行う。 センスもアンチセンスも同じ鋳型で転写が可能。 この両者のような方法で直鎖化(リニアライズ)した鋳型DNAを調製し、RNAポリメラーゼなどと混ぜてin vitro 転写反応をした後、RNAを精製すればRNAプローブのできあがりです。 〜ハイブリダイゼーションの補足説明 DNAは、G グアニン 、A(アデニン)、T チミン 、C(シトシン)、RNAはG グアニン 、A(アデニン)、U ウリジン 、C(シトシン)の 4種類の塩基から成り立っています。 この4種類の並び方=配列が遺伝情報をコードします。 配列には方向性があり、普通は生体内の合成方向に従って記載しま す。 DNAは通常2本の分子が逆方向にからみあった構造をとっています。 その際、GとC、AとTが結合し合います。 このように互いに結合し合う分子のことを「相補的 complementary 」と呼びます。 一方RNAは生体内で1本鎖として機能します。 RNAは2本の分子からなるDNAの情報を写し取る(転写)ことによって、核内にあるDNA情報のコ ピーとして働きます。 ややこしい話になりますが、転写のメカニズムを少し説明します。 DNAは遺伝情報そのもので、数千から数十億もの塩基が切れ目無しにつながっています。 RNAは普通その一部だけが転写されます。 転写が始まる場所は プロモーターと呼ばれる制御配列によって指定されます。 さてDNAは2本鎖に対しRNAは一本鎖ですから、転写される配列は2本鎖のどちらか一方になりま す。 RNAと同じ情報を持つ側をセンス鎖(もしくはコード鎖)、反対側をアンチセンス鎖と呼びます。 位置関係を図に示します。 図示したように、転写の際には互いに結合し合うDNA分子は一時的に解離し、アンチセンス側の配列を鋳型としてそれに相補的なRNAが、プロモーターに近 い場所から順番に合成されます。 このメカニズムによりセンス側のDNAの配列情報とRNAの配列情報が一致するわけです。 このような操作をハイブリダイゼーション(略してハイブリ)と呼びます。 脳をどの方向から切るかによって、当然見え方は変わってきます。 切片を見る場合どんな切り方をしたかを まず知る必要があります。 何はともあれ次の3つの言葉を覚えましょう。 脳を前から後へ向かって輪切りにしていく切り方。 脳を上から下へ、水平に切っていく切り方。 MRI画像など。 脳を左から右へ縦に切る切り方。 中心軸から少しずれるのでparasagittalと呼んだりもする。 最初は解剖学用語は、似たような名前があちこちに出没してちんぷんかんぷんだと思いますが、相対的な位置関係を示す言葉をまず覚えると理解が進みます。 もしくは 〜脳アトラス ISHなどで染色した切片でどんな構造が染まっているかを調べるには、脳アトラスが助けになります。 私たちがよく使うアトラスは以下の通りです。 <ラット> by George Paxinos, Charles Watson ・・・恐らくもっともpopularなアトラス by Pascal Carrive、Hongqin Wang、Ping-Yu Wang、 George Paxinos by Laura Kus、Ken W. Ashwell、Charles Watson、 George Paxinos ・・・抗体染色のアトラス。 <マウス> by Keith B J Franklin George Paxinos ・・・Paxinosアトラスのマウスバージョン <アカゲザル> by George Paxinos、Xu-Feng Huang、 Arthur W. Toga ・・・Paxinosアトラスのサルバージョン 最近はウェブ上でも、いろんなデータベースがあります(参照)。 簡単にマウスの脳で遺伝子発現分布を見るにはが便利。 2万遺伝子のマウス成体脳での発現が調べられます。 リファレンスの脳アトラスは力作です。 ただし Allen Atlasは少しバックグラウンドが高いので要注意。 NCBIのEntrezとリンクしているも 参考になります。 Allen Atlasほどの規模ではありませんが、成体脳だけでなく生後脳のISH画像も公開しています。 GENSATは、もともとBAC transgenicライン作成の大規模プロジェクトなので、既知遺伝子の転写制御配列でGFPをドライブした画像が調べられます。 マウス脳の発生過程でのISHパターンが知りたければ、が 参考になります。 マウス以外の遺伝子発現データベースは、まだいいものがありません。 今後、発展しそうなのが、。 サルなどいくつかの種のさまざまな画像データが保管されており、他のデータベースへのリンクも豊富なので、参考にすると良いと思います。 業界用語辞典 ラボに入ると、辞書にも載っていない耳慣れない用語に出会ってとまどうことがあります。 そこで、そういった「業界用語」を集めて解説してみました。 ただし 非常にパーソナルな経験に基づいているので、どれくらい一般的かは不明。 <もれきゅら> ベクター:プラスミドベクターのこと。 最初期のベクターはpBR322だが、プラスミドコピー数が少ないので、特殊な用途以外はpUC系のハイコピープラ スミドに取って代わられた。 ちなみにpUCの複製起点はpBRのものにmutationが入っているので、コピー数の制限がかからなくなっている。 現在出 回っているほとんどのベクターは、pUC系の複製起点を持つ。 pBlueScript, pSP, pEMBLなどなど。 ちなみにウイルス屋さんは、治療用のウイルスベクターのことを「ベクター」と呼んで、野生型ウイルスと区別したりするらしい。 インサート:ベクターに挿入するDNA断片のこと。 コンストラクト:プラスミドとほぼ同義。 プラスミド作成のデザインのことを指すこともある。 フェノクロ:フェノールクロロホルム処理 ペレット:沈殿 アンプ:アンピシリン あおしろ:Blue-White selection。 オーバーナイト:一晩置くこと。 人によって長さは違う。 標準的には16時間くらいだが、8時間以上ならOKな場合が多い。 ガンマ(ギリシャ文字のg):マイクログラム ラムダ(ギリシャ文字のl):マイクロリットル 一部の研究室で「フツー」に使われる用語。 文化圏があるらしい。 アメリカ由来?かつてはピペットマンの代わりに使われていたガラスのマイクロピペットの容 量表示にラムダと書いてあった。 ハイブリ:ハイブリダイゼーション アルフォス:アルカリンフォスファターゼ。 ISHでdetectionに使われる酵素のことを指すことが多いと思うが、CIPのこともアルフォスと呼ぶ人 もいる。 でぷし:DEPC。 ディーイーピーシー、デペックなどとも呼ぶ。 えれぽれ:エレクトロポレーション せしくろ:CsCl(セシウムクロライド)のこと。 もしくはCsCl超遠心濃度勾配を使ったプラスミド精製法のこと。 (用例)せしくろを回す(CsClの 超遠心を行うこと)。 せしくろグレード。 かつては、「きれいなプラスミド」が必要なときは、CsClの超遠心にかけたものだった。 Quiagen社のキッ トが出回るようになって、ほとんど死語と化した。 コンタミ:コンタミネーション contamination。 培養細胞に菌が生えた場合や、RI汚染をしたときなどに使う。 ピペット操作の不備でサンプ ルが混ざってしまった場合、「クロスコンタミした」などとも言う。 RNAプローブが壊れている場合、RNAseがコンタミしている可能性が高い。 エチブロ:エチジウムブロマイド EtBr。 核酸の染色に使用。 発ガン性があるので注意。 セントラルドグマ: Crickらが提唱した、遺伝機構のモデル。 DNAが遺伝子の 実体で、その遺伝情報はGATCの塩基配列情報として世代から世代へ受け渡される。 DNAが「遺伝暗号」としてコードするのは、タンパクのアミノ酸配列で ある。 DNAの塩基配列は、RNAポリメラーゼによってmRNA(メッセンジャーRNA)に「転写」される。 mRNAの配列は、tRNA(トランスファー RNA)を介してタンパクに「翻訳」される。 以上のステップによって遺伝子機能が「発現」する。 このモデルはバクテリアからヒトまで共通する普遍的な機構 であるとされ、「セントラルドグマ」と呼ばれる。 なお現在は、遺伝子から機能発現までの経路は、Crickが考えていたよりはるかに複雑であることが分かっている。 たとえば、真 核生物で は、DNAの配列には「イントロン」が存在し、mRNA splicingを受けなければ、機能的なmRNAはできない。 またRNAウイルスは、RNAゲノムを逆転写酵素によってDNAに戻す操作を行う。 最近は タンパクをコードしないRNA分子が想像以上に多く存在することが分かってきたが、これらのRNAの役割はいまだによく分かっていない。 また最近では遺伝 子配列としてコードされていない「エピジェネティック」な情報の役割が重視されている。 顕微鏡で高倍率で見ることをさす。 じゃっかく:弱拡大。 低倍率の顕微鏡観察。 ニッスル:Nissl染色。 よくNissleと間違えるので注意。 神経系の基本染色の一つで、主にニューロンを染める。 核酸を青く染める。 「ニッスル染 色」とは、実際にはcresyl violetとか、thioninなどの染色試薬を使った染色の総称である。 いんさいちゅ:in situ hybridization histochemistry。 ヒトによっていんさいちゅといったり、いんしちゅと言ったりする。 ひすと:histology。 組織学的解析。 免染:免疫染色 カメラルシダ:顕微鏡画像を紙に投影して、マニュアルで模写する技術のこと。 写真ではとらえきれない特徴を忠実に再現したり、さまざまな量の測定(面積、 長さなど)を行うのに古く(カハールの時代から)使われる手法。 今でもコンピューターを使って似たようなことをしている(ニューロルシダ)。 ニューロルシダ:Neurolucida。 くわしくは。 トレーサー:神経間の連絡を調べるために使う標識物質。 アクソンターミナルから取り込まれ、細胞体に輸送される逆行性トレーサーと、細胞体で取り込まれア クソンターミナルに輸送される順行性トレーサーがある。 1970年代初頭にトレーサー技術が導入されるまでは、ターゲットの壊死に起因する逆行性ニューロ ン変性を指標にしたNauta法が広く使われた。 最初期のトレーサーは、アイソトープ標識したアミノ酸(順行性)や、HRP horse radish peroxidase 、WGA wheat germ agglutinin -HRP(両方向)で、現在では、FastBlue, FluoroGold, FluoroRuby, DiIなどの各種蛍光トレーサーの他、BDA, CTB, latex beadsなどさまざまなオプションがある。 面出し:凍結、パラフィンなどで固めた組織ブロックを薄切切片にするとき、必要な断面が出てくるまで少しずつ切り進める作業のこと。 金コロ:金コロイド粒子。 電子顕微鏡免疫染色の際、標識に使う。 以上 文責 渡我部.

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ブルー・ホワイトセレクション

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背景 [ ] 分子クローニングは、で最も一般的に使用される手順の1つである。 目的の遺伝子はを介してプラスミドベクターに挿入され、このプラスミドによって 細胞は形質転換される。 ただし、細胞を形質転換したすべてのプラスミドに目的の遺伝子挿入物(インサート)が含まれているわけではなく、インサートの存在について個々のコロニーをチェックするのは時間がかかる作業である。 したがって、インサートの有無を検出する簡便な方法は、この手順の時間と労力を削減するのに役立つ。 インサートの検出のために開発された初期の方法の1つは、コロニーの色でクローニング反応の成功した産物の同定を可能にする、このブルー・ホワイトセレクション(青白スクリーニング)である。 最初の145アミノ酸をコードする配列を含むは、後にMessing らによって構築された。 VieiraとMessingによるプラスミドクローニングベクターのpUCシリーズはM13システムをもとに開発され、このスクリーニング法を利用するために構築された最初のプラスミドだった。 したがって、インサートを含むプラスミドで形質転換された細胞は白いコロニーを形成し、インサートのないプラスミドで形質転換された細胞は青いコロニーを形成する。 このように、ライゲーションの成功は白いコロニー形成となり、失敗は青いコロニー形成によって容易に識別できる。 どちらも単独では機能しない。 組換えクローンは、形質転換コロニーから少量のプラスミドDNAを分離および精製することによりさらに分析でき、制限酵素を使用してクローンを切断し、目的のフラグメントがあるかどうかを判断できる。 DNAの配列を決定する必要がある場合、制限酵素を使用して切断するか、他のアッセイを実行するかに関わらず、コロニーのプラスミドをある時点で分離する必要がある。 実施上の配慮点 [ ] 正しいタイプのとを使用することは、ブルー・ホワイトセレクションを計画する際の重要な実施上の配慮点である。 lacオペロンはグルコースの存在によって影響を受けることも理解されるべきだ。 グルコースのとりこみに関与するタンパク質EIIA Glcは、グルコースが細胞内に輸送されるとラクトース透過酵素をシャットダウンする。 したがって、寒天プレートではグルコースを含まない培地を用いるべきである。 X-galは光に弱いため、X-galを含む溶液とプレートは暗所で保管する必要がある。 lacオペロンのインデューサーとして機能する (IPTG)は、LacZの発現を高めるために培地で使用できる。 は高価な材料であるため、細菌をスクリーニングするために他の方法が開発されている。 細菌のスクリーニングを支援する代替手段として、を利用する技術が開発されている。 GFPは一般にレポーター遺伝子として使用されており、研究者が分析している遺伝子がクローンに含まれているかどうかを、研究者自身が明確に判断できる。 コロニーが成長する培地が選別に影響を与え、の結果をもたらす可能性がある。 培地上のX-galが時折分解して青色を発したり、GFPが培地のために蛍光を失ったりすることがあり、研究者が希望する組換え体とそれを持たないコロニーを決定する能力に影響を与える可能性がある。 欠点 [ ] 白いコロニーには、いくつかの理由で目的の組換えプラスミドが含まれていない場合がある。 ライゲーションされたDNAが正しいものではないか、適切に連結されていない可能性がある。 ベクターをまったく持たないコロニーも白く見え、使用するが枯渇した後にサテライトコロニーとして現れることがある。 青いコロニーにインサートが含まれている可能性もある。 正しい組換えコンストラクトが明るい青色のコロニーを生成することもあり、同定が複雑になる場合がある。 脚注 [ ]• Ullmann, A. ; Jacob, F. ; Monod, J. 1967. Journal of Molecular Biology 24 2 : 339—343. Langley, K. ; Villarejo, M. ; Fowler, A. ; Zamenhof, P. ; Zabin, I. 1975. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 72 4 : 1254—1257. Messing, J. ; Gronenborn, B. ; Hans Hopschneider, P. 1977. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74 9 : 3642—3646. Vieira, J. ; Messing, J. 1982. Gene 19 3 : 259—268. Joseph Sambrook, David Russell. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 1 3rd ed. , Ninfa, Alexander 1998. Ballou, David P.. Bethesda, Md. : Fitzgerald Science Press. 355—356. Speltz, Elizabeth B. ; Regan, Lynne June 2013. Protein Science 22 6 : 859—864. Banerjee, Sampali; Kumar, Jitendra; Apte-Deshpande, Anjali; Padmanabhan, Sriram 2010-05-11. Microbial Cell Factories 9: 30. Banerjee, Sampali; Kumar, Jitendra; Apte-Deshpande, Anjali; Padmanabhan, Sriram 2010-05-11. Microbial Cell Factories 9: 30. 関連項目 [ ]• pBLU• pGreen• pUC19•

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プラスミドとファージベクターの使い分けについてそれぞれ具体的にどう...

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Q 題字の如くなのですが、プラスミドの大量調製が思いのほかうまくいきません。 low-copy plasmidかとも疑い、培地の量をかえてトライもしてみましたが、こちらでもうまくいかないんです。 培地には抗生物質を添加しているので、プラスミドを持たない大腸菌が急増するということは考えにくいですし、やはり細胞内でのコピー数が少ないと考えています。 何か工夫すべき点がありましたら、ご教授願います。 A ベストアンサー まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。 low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。 プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。 promega. html P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。 それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。 たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。 大量培養した時にもそこから1mlとってちゃんと増えていることを確認したほうがいいかとおもいます。 実際の大量調整の時にはどの方法を使ってどのスケールでやっているのでしょうか。 アルカリSDS法かその変法のキットを使っていると思いますが、 ちゃんとリシスしているのか誰かわかる人に確認してもらったほうがいいと思います。 大腸菌が壊れていなければプラスミドは出てこないでペレットとして捨てられることになります。 抗生物質の濃度は適当なのでしょうか。 場合によっては2倍くらいにしたほうが収量がよくなることがあります。 もしかりにlow-copyのプラスミドならば 途中でクロラムフェニコールを加えることにより大腸菌の増殖を止めてコピー数を増やすことができることがありますが、 コピー数が少ないプラスミドをわざわざ使っている時には、コピー数が増えると組換えを起こすようなインサートが入っていることがあるので 事前に調べておく必要があります。 まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。 low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。 プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。 promega. html P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。 それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。 たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。 大量培養した... A ベストアンサー こんばんは。 もう答えは出ておりますので、補足を少しします。 プラスミドベクターはハイコピーの物とローコピーの物があります。 一つの細胞内 ここでは大腸菌一体の事をさします。 で増えるプラスミドの量はベクター内の複製起点及びそ周辺のDNAシークエンスによって異なります。 pUC、pBR系などの有名なハイコピーベクタープラスミドの複製起点はColE1をアレンジした配列が含まれており、一細胞内で500程度のコピー数になります。 それに反してpACYC系に見られるローコピーベクタープラスミドはp15の様な複製起点が厳密に定義されている物はコピー数が少ないです。 これによって一細胞内でのコピー数は20-30程度です。 この様に考えますとベクターコピー数も収量に大きく関与するファクターと言えます。 1さんは恐らくハイコピープラスミドベクターのオーバナイトカルチャーの事をご指摘されているのだと思います。 下らない補足、失礼致しました。 Q PCR後の精製産物をシークエンスするダイレクトシークエンスとクローニングしてプラスミド回収してからのシークエンスの2パターンで配列解析をしました。 するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。 一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。 今回このような結果になったのは、たまたまなのでしょうか? またダイレクトシークエンスの長所は、クローニングをしないので短期間でシークエンスが可能。 短所は読めない配列が多いと聞いたことがあります。 そこでクローニング済みのシークエンスのほうの長短所って何なのでしょうか? 回答よろしくお願いします。 A ベストアンサー こんにちは。 実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。 ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。 ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。 ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき(ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります)、次のようなメリットが考えられます。 ・(メリット)そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること ・(メリット)シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。 正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。 クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、 ・一見、単一の産物に見えても1塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。 ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。 ・(先の方も書かれていますが)基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用(発現用のベクターに入れる)にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。 クローニングしたプラスミドを読む場合はインサートの長さにもよりますが、最低3個くらい読んだ方が良いと思います。 プラスミドのシーケンスがうまくいかなかったとのことですが、制限酵素で確認されたのことでものは入っているのだと思います。 シーケンシング反応はエタ沈がちょっとマズイだけでシーケンスが読めなくなったりするので、もう一回同じ事をやると読めるようになるかもしれません。 シーケンシングプライマーですが、プラスミドにあるシーケンシングプライマーの配列(T7, SP6, M13など)が実は、シーケンシング反応に有利な配列でないことがあります。 最近は合成オリゴの値段も安いので、「同じ配列を複数読む」ようなことであれば、自分の入れたインサートにある配列でシーケンスされるのがよいと思います。 「中から外に読む」感じです。 もし、サイズが500bpとか小さいようならPCRで増やしたときに使ったfowardとreverseプライマーで網羅できるでしょう。 あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。 また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。 がんばってくださいね! こんにちは。 実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。 ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。 ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見... Q 分子生物初心者でよくわからないんですが・・・ pcDNA3っていう哺乳動物用のベクター、ご存知の方に質問したいのです。 pcDNA3に、発現させたい目的遺伝子を組み込んだ場合、N末ないしC末にtagって付加されますか? ベクターの構造をみてもさっぱりで;特にtagに関する表記はされてないように思うのです。 じゃぁ、発現させた後は、その目的タンパクの抗体で検出するしかないの?と感じています。 それとも、大腸菌用ベクターで予めtag付きで構築して、その付加されたtag部分もろとも切り取って、pcDNA3に組み込んで、tag付きタンパクとして発現させるんでしょうか?? ベクター構築初挑戦?者の質問ですので、表現が変だったらごめんなさい。 なにより、0. 2 mMは濃すぎます。 0~2. 2~0. Q 植物を実験材料として扱っているのですが、植物からある特定の遺伝子を単離して、発現ベクターへ組み込む際、RT-PCR等でまずその特定の遺伝子を単離したとします。 この単離した遺伝子をまずpUC119等のベクターに組み込んでシークエンス解析を行い、配列が正しいか確認します。 シークエンス解析をし、あたりの配列をまた切り出して、発現ベクターへ組み込みます。 この作業において、僕は今までそれぞれここの作業はクローニング、実験系全体を見ると、pUC119に導入するのはサブクローニングで、発現ベクターに導入するのがクローニングだと思っていたのですが、どうも違うようなのです。 どなたかこの2つの言葉の違いをはっきりとした定義を教えていただけないでしょうか?(まわりくどい説明で申し訳ありません) A ベストアンサー 遺伝子等の「クローニング」を小難しく言えば、ゲノムDNAやcDNAを増殖可能なベクター・宿主系に組込み、特定の配列を持つものを得るということになるでしょう。 サブクローニングもクローニングの内です。 サブクローニングとは、クローニングのなかでも特に、いったんクローニングした配列の中から、一部の断片(sub-fragment)を二次的にクローニングすることです。 たとえば、BACやファージをベクターとしたゲノムライブラリーから、目的の領域を含むものを単離した後、その中から必要な断片だけをプラスミドベクターにクローニングし直すときに「サブクローニング」と言います。 一方、ご質問の例のように、クローニングされている断片の全長を別のベクターに入れ直すのは、「リクローニング recloning」という語を使い、サブクローニングとは言わないと思います。 Q コンラージ棒を用いて、形質転換した菌液を希釈別にLB固体培地に撒く作業が上手くできません。 先輩、先生に教えて頂いたやり方を実践していますが、菌が中央に寄ったり、ドーナツの様になったり、コンラージ棒の跡が残ったり、コロニーの大きさに差が在りすぎたりします。 以上です。 改善すべき点やその他の原因をお持ちでしたら、ご意見を頂けると嬉しいです。 宜しくお願いします。 コンラージ棒を用いて、形質転換した菌液を希釈別にLB固体培地に撒く作業が上手くできません。 先輩、先生に教えて頂いたやり方を実践していますが、菌が中央に寄ったり、ドーナツの様になったり、コンラージ棒の跡が残ったり、コロニーの大きさに差が在りすぎたりします。

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